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背景介绍
大块骨缺损的修复仍受限于骨组织再生速度缓慢，可能导致骨不连以及植入物血管化不足，损害缺损部位细胞的存活和功能。作为替代方案，模拟天然骨痂的骨痂类器官已成为能够支持快速骨缺损修复和再生的自主骨化中心。通过重现软骨内成骨的发育程序，骨痂类器官实现自组织和自适应，为大块骨缺损的生理性再生提供了潜在突破。因此，调控骨痂类器官的生长和发育代表了一种加速骨再生的可行策略。骨痂类器官能够重现天然骨折骨痂的功能特性。Xie等人报道，骨痂类器官在兔股骨节段性缺损模型中4周内实现超快速骨再生，而传统修复策略通常需要2-3个月才能达到相当的结果。然而，当前构建骨痂类器官的方法通常依赖Matrigel为基础的培养，缺乏建立功能性血管网络的能力。这可能导致大块骨缺损中心区域的营养剥夺和细胞坏死，最终导致异质性组织再生。值得注意的是，生物活性硅酸盐陶瓷，如硅酸镁，可通过持续释放生物活性离子支持内皮网络稳态，可能是因为Mg²⁺与SiO₄⁴⁻协同并通过模拟低氧微环境稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），从而上调VEGF表达。总体而言，硅酸镁生物陶瓷可能代表调控骨痂类器官血管化的有前景候选者。类器官培养基质的机械性能在指导类器官形态发生、分化轨迹和最终功能命运中也发挥关键作用。例如，基质粘弹性调控肾单位结构的空间排列和形态复杂性，从而促进肾类器官成熟。Matrigel因其与天然细胞外基质的组成相似性而被广泛用作类器官培养基质。然而，Matrigel缺乏骨痂类器官最佳发育所需的可调机械性能。有提出将硅酸盐生物陶瓷掺入水凝胶可通过增强界面相互作用和水凝胶分子网络内的应力传递来增强刚性和粘弹性。纳米颗粒形态在调控骨类器官复合水凝胶机械微环境中的作用和机制在很大程度上仍未探索。因此，本研究的目的是制备硅酸盐生物陶瓷调控的骨痂类器官，并研究其对类器官发育和骨组织再生的影响及潜在机制。制造骨痂类器官的方法关键决定其转化潜力。传统类器官制造严重依赖手动滴加，劳动密集且难以确保尺寸均匀性。液滴微流控技术通过精确控制分散相和连续相的流速提供了一种有前景的方法，能够高通量生成尺寸和组成均匀的水凝胶微球。因此，将该技术与生物陶瓷工程化水凝胶整合可能提供将可扩展、可重现的类器官制造与生化和机械可调培养微环境相结合的机会。
研究思路
针对上述挑战，中国科学院上海硅酸盐研究所吴成铁教授、马红石教授等团队设计并制造了一种液滴微流控芯片，能够生成尺寸均匀且高通量的复合水凝胶微球。合成了不同形态的硅酸镁以调控离子和机械微环境。随后，通过液滴微流控技术制备了封装人骨髓间充质干细胞（HBMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的硅酸镁工程化复合水凝胶微球。在体外培养7天后，在硅酸镁刺激下，复合水凝胶微球发育为血管化骨痂类器官。团队随后表征了类器官内软骨内成骨过程，表明硅酸镁调控的类器官有效重现了HBMSCs在此过程中的多种细胞活动。团队进一步发现形态依赖性硅酸镁调控复合水凝胶的机械性能，从而调节骨痂类器官发育。用硅酸镁纳米管培养的类器官表现出完整的 endothelial 网络以及优异的机械响应性和矿化能力。为阐明硅酸镁纳米管介导类器官发育的分子机制，团队进行了全面的转录组测序。最后，建立大鼠股骨髁缺损模型以评估这些类器官在体内对血管化骨再生的效果。与不含生物陶瓷的骨痂类器官相比，硅酸镁纳米管调控的骨痂类器官在植入6周内促进骨再生，并促进骨缺损核心的血管网络形成。相关内容以 Silicate Biomaterials-Stimulated Vascularized Callus Organoids for Bone Tissue Regeneration 发表在 Advanced Materials！
图片解析
图1. 通过液滴微流控芯片高效制备硅酸盐生物陶瓷工程化水凝胶及其在刺激血管化骨痂类器官用于骨组织再生中应用的示意图。
图2. 硅酸镁工程化复合水凝胶微球的制备和表征：(a) 不同形态硅酸镁纳米颗粒的SEM图像和元素映射图像；(b) 硅酸镁的XRD分析；(c) 微流控芯片示意图和照片；(d) 不同水/油相流速下水凝胶微球的粒径统计；(e) 水/油相流速为4/11时水凝胶微球的光学图像；(f) 含不同形态硅酸镁的复合水凝胶微球的SEM图像。
图3. 形态依赖性硅酸镁有效调控复合水凝胶的机械性能：(a) 不同复合水凝胶的压缩模量；(b) 不同复合水凝胶的储能模量和损耗模量；(c) 30%单轴压缩条件下压力场和应力分布的有限元模拟分析；(d) 静水压条件下压力场和应力分布的有限元模拟分析。纳米管形态的硅酸镁不仅可调控复合水凝胶的整体机械性能，还可调控复合水凝胶内应力的空间分布。
图4. 浓度依赖性硅酸镁工程化复合水凝胶调控骨痂类器官软骨内成骨过程中的软骨和成骨分化：(a) 骨痂类器官制备和培养示意图；(b) MMP-13、Aggrecan、Col2a1和Sox9蛋白的荧光染色图像；(c) MMP-13、Aggrecan、Col2a1和Sox9蛋白平均荧光强度统计；(d) 成骨分化相关基因（OPN、BMP2、RUNX2）和血管化（VEGF）相关基因的表达。2 wt.%浓度的硅酸镁可驱动骨痂类器官的发育过程。
图5. 形态依赖性硅酸镁工程化水凝胶促进骨痂类器官中的内皮网络组装和血管生成：(a) CD31和PDGFRβ蛋白的免疫荧光染色图像；(b) PDGFRβ蛋白荧光面积统计；(c) 第7天血管内皮网络的代表性免疫荧光染色图像；(d) CXCL12和HIF-1α基因的表达；(e) FGF2、KDR、PDGFRβ和CD31基因的表达。第7天，2NT-GM组形成完整的血管网络，血管密度和管腔结构显著增加，为骨痂类器官的功能性血管化提供了结构基础。
图6. 形态依赖性硅酸镁复合水凝胶为骨痂类器官提供有利的机械微环境：(a,b) 不同复合水凝胶的杨氏模量；(c) FAK蛋白的免疫荧光染色图像；(d) 肌动蛋白和肌球蛋白的免疫荧光染色图像；(e) YAP核转位的免疫荧光染色图像；(f) 核YAP表达的定量分析；(g) 硅酸盐增强基质刚度促进整合素聚集、FAK激活和后续YAP核转位，最终驱动TEAD介导的成骨转录的提出信号机制示意图。
图7. 骨痂类器官中矿化基质沉积的表征和特定分子机制的探索：(a) 培养7天的骨痂类器官的组织学染色图像；(b) 各组间基因差异的火山图；(c) 各组间基因差异的维恩图；(d) Cell组与2NT-GM组之间KEGG通路的富集分析；(e) Cell组与2NT-GM组之间GO通路的富集分析；(f) GM组与2NT-GM组之间机械相关基因的热图；(g) GM组与2NT-GM组之间软骨成骨再生相关基因的热图；(h) GM组与2NT-GM组之间KEGG通路的富集分析。激活的机械传感相关通路，包括ECM-受体相互作用和PI3K-AKT，是2NT-GM促进骨痂类器官中软骨和成骨分化、基质矿化和血管化的关键机制。
图8. 骨痂类器官促进股骨髁缺损修复和再生的体内探索：(a) 大鼠股骨髁缺损模型建立和BOs/2NT-GM植入过程示意图；(b) 6周时不同组骨缺损的代表性Micro-CT图像（红色为新骨）；(c) 6周时新形成骨体积/总体积（BV/TV）和骨表面积/总体积（BS/TV）的统计分析；(d) 缺损部位骨组织的Masson、HE和番红O-固绿染色图像。生物陶瓷调控的血管化骨痂类器官在体内促进形成良好整合且均匀组织的新骨。
图9. 大鼠股骨髁缺损组织学分析和血管化骨再生能力的体内评估：(a) 6周时骨缺损部位组织样本的CD31免疫组化染色图像；(b) 6周时骨缺损部位组织样本OCN、eNOs的免疫荧光染色图像；(c) OCN、eNOs蛋白平均荧光强度统计；(d) 6周时骨缺损部位组织样本Col1、Col2、Vinculin和YAP的免疫荧光染色图像；(e) Col1、Col2、Vinculin和YAP蛋白平均荧光强度统计。硅酸镁纳米管调控的骨痂类器官有效促进血管生长和重塑，并促进体内血管化骨组织再生。
结论
该研究开发了一种微流控辅助的硅酸镁工程化复合水凝胶，重现天然骨痂微环境用于血管化骨痂类器官工程。团队发现硅酸镁工程化复合水凝胶提供生化龛，激活骨痂类器官的软骨内成骨，包括软骨分化、软骨细胞肥大和基质重塑，归因于生物活性Mg²⁺和硅酸盐离子的持续释放。值得注意的是，2NT-GM表现出优异的机械增强并产生空间分布的机械微环境，加速内皮网络组装。2NT-GM还有效调控内应力分布，稳健激活YAP依赖性机械转导信号，驱动骨痂类器官的成熟和重塑。此外，2NT-GM有效促进软骨和骨基质组分的沉积和空间组织。转录组分析进一步揭示，2NT-GM主要增强ECM-受体相互作用和钙信号通路，这些通路调控类器官基质构建、细胞微环境感知和类器官结构模式化。在大鼠临界尺寸股骨髁缺损模型中，血管化BOs/2NT-GM实现显著加速的骨再生，伴随稳健的血管化和成熟基质沉积。总之，该液滴微流控平台结合2NT-GM建立了通用、可扩展的仿生骨痂类器官工程策略，代表了血管化骨修复的有前景的治疗方法。该研究的局限性包括：体外和体内实验使用了不同的细胞来源，尽管基于人类细胞的模型为评估硅酸镁对人类骨痂类器官发育的影响提供了转化相关性，但体外人类骨痂类器官中观察到的分子和细胞反应不能假定与体内大鼠来源类器官中发生的完全相同；未来使用统一人类细胞在适当免疫缺陷大鼠或人源化骨缺损模型中的研究可能有助于进一步建立该系统的转化相关性。