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背景介绍
鉴于供体肝脏持续短缺，肝组织工程（LTE）已成为肝移植的一种有前景的替代方案。LTE通常将肝细胞或干细胞与生物材料结合，构建能再现天然肝脏结构和生理关键特征的三维微组织。过去十年间，多种LTE策略（包括细胞片、补片移植、藻酸盐包封肝细胞、脱细胞支架构建体和3D生物打印组织）已显示出对肝损伤的治疗潜力。然而，LTE仍面临若干关键挑战：首先，原代肝细胞在体外易发生失巢凋亡，导致细胞极性丧失和功能衰退；其次，移植物原性和手术操作可能触发炎症和免疫排斥，损害移植细胞的存活和功能；第三，血管化不足会损害移植物的存活、功能和增殖。因此，维持肝细胞极性、调节炎症和加速血管化对于推进LTE临床转化至关重要。生物材料有望应对这些挑战，它们不仅能模拟细胞外基质（ECM）微环境以保持肝细胞极性和功能，还能调节免疫细胞极化和促进血管生成。血清白蛋白是一种内源性非糖基化蛋白，约占血浆总蛋白的60%；作为生物材料，白蛋白因可及性、稳定性、可持续性、非免疫原性和低成本而具有临床吸引力，此外白蛋白可来源于患者自身，进一步降低免疫风险并实现个性化治疗。白蛋白基水凝胶可模拟ECM并支持多种细胞的3D培养，包括干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞和肝癌细胞，也可用作伤口愈合、脊髓修复和骨再生等再生应用的支架。此外，白蛋白基水凝胶具有免疫调节作用，例如光交联白蛋白水凝胶可抑制巨噬细胞活化并减少促炎因子（包括IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1）的表达；白蛋白还可作为涂层基质，通过减少脑驻留细胞黏附和促炎及神经毒性细胞因子分泌来增强中枢神经系统记录电极的生物相容性。尽管白蛋白基水凝胶具有良好的生物相容性和免疫调节特性，但缺乏多样化的生物活性成分。因此，将ECM衍生的生物活性成分掺入白蛋白水凝胶以构建复合水凝胶，是解决这一局限的有效策略。脱细胞细胞外基质（dECM）为提供组织特异性生化和生物物理线索提供了互补策略，dECM通过去除细胞和核成分同时保留ECM的组成和结构而生成，可在再生医学中广泛用于肝、心、肺、肾等整个器官和组织的重建。dECM可通过酶解加工成水凝胶，在此过程中释放称为基质因（matrikines）的生物活性肽。基质因被认为是dECM在多种生物过程中生物活性的关键介质，包括细胞黏附、增殖、分化、功能成熟、极性建立、组织修复与重塑、血管生成和免疫调节。此外，dECM支架和水凝胶可保留生长因子，包括FGF、EGF、VEGF、CTGF和TGF，从而支持内皮增殖和迁移，并在体外和体内促进血管化。dECM水凝胶还可作为细胞载体招募宿主内皮细胞并加速新生血管化。研究团队此前工作表明，肝dECM支架具有强大的血管生成潜力，并增强移植原代肝细胞或间充质干细胞球体的血管化；同样，肝dECM水凝胶提供组织特异性3D微环境，支持血管生成和植入物与宿主组织的整合。
研究思路
针对上述挑战，四川大学华西医院包骥教授、杨家印教授、Wu Qiong 教授团队提出并开发了一种仿生复合水凝胶，将白蛋白的良好生物相容性与肝dECM的组织特异性生物活性相结合。团队合成了可光交联的牛血清白蛋白甲基丙烯酸酯（BSA-MA），并将其与源自α1,3-半乳糖基转移酶敲除（GTKO）巴马小型猪肝脏的肝dECM共混。首先评估了不同比例BSA-MA与肝dECM共混制备的BSA-MA-dECM溶液的交联效率，然后表征了水凝胶的理化性质、细胞相容性和组织相容性；进一步在体外和体内评估了水凝胶的免疫调节和促血管生成能力，并分析了潜在的促血管生成机制；将原代肝细胞球体包封于BSA-MA-dECM水凝胶中构建工程化肝组织（EHT），在体外评估肝细胞活力和功能，将EHT植入肝损伤大鼠大网膜后评估肝细胞扩增和血管生成，最后通过血清生化检测、组织学检查和转录组测序评估EHT对肝损伤的治疗效果。相关内容以Programming a Pro-Regenerative Microenvironment via a Photocurable Albumin-Matrix Hydrogel for Hepatic Tissue Reconstitution发表在Biomaterials！
图片解析
图1. BSA-MA-dECM水凝胶用于重建工程化肝组织以治疗肝损伤的示意图，上部分为BSA-MA-dECM水凝胶评价（理化性质、生物相容性、免疫调节作用包括M0向M2极化、促进血管生成），下部分为EHT在CCl₄诱导肝损伤中的治疗效果（肝功能恢复、肝纤维化消退、潜在治疗机制包括代谢稳态、解毒能力、ECM合成、炎症反应）。
图2. BSA-MA和BSA-MA-dECM水凝胶的制备与理化表征：(a) BSA-MA合成示意图；(b) BSA及BSA-MA-0.25、0.5、1、2、3的¹H NMR谱；(c) 甲基丙烯酰化度（DM）；(d) CD谱；(e) 二级结构分数（%）；(f) 405 nm光照下BSA-MA-2和BSA-MA-dECM溶液的光流变学分析；(g) BSA-MA和(h) BSA-MA-dECM水凝胶的SEM图像；(i) 孔径、(j) 压缩模量、(k) 溶胀率和(l) 质量保留率。
图3. BSA-MA和BSA-MA-dECM水凝胶的体外细胞相容性：HepG2细胞包封于Matrigel、BSA-MA水凝胶（7.5%、10%、15% BSA-MA-2）和BSA-MA-dECM水凝胶（10% BSA-MA-2 + 2.5、5、10 mg/mL dECM）中——(a) 明场图像；(b) 活（calcein AM，绿色）/死（碘化丙啶，红色）染色；(c) H&E染色；(d) PAS染色；(e) 球体直径定量；(f) 细胞活力定量。
图4. BSA-MA和BSA-MA-dECM水凝胶在皮下组织中的生物相容性：Matrigel、BSA-MA水凝胶和BSA-MA-dECM水凝胶皮下植入大鼠——(a) WBC、(b) 淋巴细胞、(c) 单核细胞和(d) 中性粒细胞的CBC分析；(e) 皮下组织H&E染色。
图5. BSA-MA-dECM水凝胶调节局部免疫反应并促进M2巨噬细胞极化：(a) 皮下植入4周后CD45、CD3、S100A9、CD68、CD206和iNOS的mIHC染色及(b)定量荧光分析；(c) 无或有IL-4刺激下CD206⁺和CD163⁺细胞比例、(d) M2巨噬细胞标志物（CD206和ARG1）基因表达、(e) M2抗炎细胞因子（TGF-β1和IL-10）分泌。
图6. BSA-MA-dECM水凝胶的促血管生成作用及潜在机制：(a) 皮下植入4周后CD31免疫组化染色及(b)定量分析；(c) Matrigel、BSA-MA水凝胶和BSA-MA-dECM水凝胶中包封HUVEC的F-actin染色；(d) 节点、连接、网孔数量和总管长度定量分析；(e) 火山图显示BSA-MA-dECM组相比BSA-MA组306个差异表达基因，包括139个上调和167个下调基因；(f-h) 上调基因的GO富集分析（BP、CC、MF）；(i) 上调基因的KEGG富集分析；(j) PI3K-AKT信号通路和(k)黏着斑通路的富集；(l) HUVEC中FAK、p-FAK、AKT和p-AKT的Western blot分析；(m) 蛋白表达定量分析；(n) 有或无LY294002处理的BSA-MA-dECM水凝胶中包封HUVEC的F-actin染色。
图7. EHT的构建与功能评价：肝细胞球体包封于Matrigel、BSA-MA水凝胶和BSA-MA-dECM水凝胶中构建EHT——(a) 第7天形态、活/死染色和F-actin染色；(b) 细胞活力定量；(c) 白蛋白分泌；(d) 尿素合成；(e) CYP酶活性和氨清除；(f) H&E、PAS及ALB、CYP1A2和E-cadherin免疫荧光染色；(g) ALB、CYP1A2和E-cadherin定量荧光分析；(h) 肝特异性基因（Alb、Cyp1a2、Cyp2e1、Cyp3a2、Hnf4a）和(i) 尿素循环相关基因（Nags、Cps1、Oct、Ass、Asl、Arg1）的相对mRNA表达。
图8. EHT的体内扩增与血管化：(a) EHT植入大鼠大网膜的示意图和(b)手术过程；(c) CCl₄⁻/EHT和CCl₄⁺/EHT组移植物的H&E染色及(d) ALB、Ki-67和CD31的mIHC染色；(e) ALB定量荧光分析；(f) ALB⁺/Ki-67⁺细胞定量；(g) CD31定量荧光分析。
图9. EHT在CCl₄诱导肝损伤中的治疗效果：(a) 血清生化指标；(b) CCl₄⁺/sham和(c) CCl₄⁺/EHT组肝组织H&E、Masson三色、PicroSirius Red和α-SMA免疫组化染色；(d) Masson三色、PicroSirius Red和α-SMA阳性染色面积定量；(e) 肝组织中Col I、LN、Hyp和TGF-β1水平；(f) 火山图显示CCl₄⁺/EHT组相比CCl₄⁺/sham组160个差异表达基因，包括45个上调和115个下调基因；(g) 上调基因和(h)下调基因的GO富集分析；(i) 上调基因和(j)下调基因的KEGG富集分析。
结论
该研究开发了一种仿生复合水凝胶，将白蛋白的生物相容性与肝dECM的组织特异性生物活性相结合。BSA-MA-dECM水凝胶具有多孔微观结构、良好的力学性能以及良好的细胞相容性和组织相容性。重要的是，BSA-MA-dECM水凝胶表现出免疫调节和促血管生成能力，减轻炎症反应，促进M2巨噬细胞极化，并通过激活PI3K-AKT通路增强血管内皮细胞活化和迁移。具体而言，BSA-MA-2的甲基丙烯酰化度达100%，CD谱显示甲基丙烯酰化未显著影响BSA二级结构；10% BSA-MA-2光固化时间仅21.7 s，加入dECM后仍低于30 s；随着BSA-MA-2浓度增加，水凝胶孔径、溶胀率和质量保留率降低而压缩模量增加，随着dECM浓度增加则呈相反趋势；10% BSA-MA-2 + 5 mg/mL dECM组HepG2球体直径达90.6 μm（与Matrigel的92.2 μm无显著差异），第14天细胞活力达94.7%；皮下植入后BSA-MA-dECM水凝胶降解较快（4周直径3.4 mm，而Matrigel为4.2 mm、BSA-MA为5.1 mm），4周时CD3、S100A9、CD68和iNOS荧光强度低于Matrigel和BSA-MA组，而CD206荧光强度更高；IL-4刺激下BSA-MA-dECM组CD206⁺和CD163⁺细胞比例、CD206和ARG1表达、TGF-β1和IL-10分泌显著高于其他组；4周时CD31阳性面积显著高于Matrigel和BSA-MA组，3D培养中形成更丰富的血管网络；RNA测序鉴定306个差异表达基因，上调基因包括VEGF家族（VEGFA、VEGF）、FGF信号通路相关基因（FGFR3、FGFR1、FGFR5、FGF2）、ECM相关基因（LAMC2、LAMP3、LAMB3、MMP1）、整合素家族基因（ITGB5、ITGA6、ITGB1、ITGA5）和PI3K-AKT通路相关基因（PIK3CA、AKT1），GO分析富集于"血管生成的正调控""内皮细胞增殖的正调控""内皮细胞迁移的正调控"及"整合素复合物""血管内皮生长因子受体结合"，KEGG富集于"PI3K-AKT信号通路""肌动蛋白细胞骨架调控""黏着斑"，Western blot显示p-AKT和p-FAK水平显著升高，LY294002处理抑制血管网络形成。作为细胞载体，BSA-MA-dECM水凝胶不仅在体外维持肝细胞活力、功能和极性（ALB、CYP1A2、E-cadherin表达及肝特异性和尿素循环相关基因表达显著升高），还在体内支持肝细胞扩增和血管化——CCl₄⁺/EHT组ALB荧光强度显著高于CCl₄⁻/EHT组并随时间逐渐增加，ALB⁺/Ki-67⁺细胞数在1、2、4周显著更高，CD31荧光强度在2、4周显著更高，8周FITC-dextran灌注显示移植物内丰富的灌注血管网络。在CCl₄诱导的肝损伤模型中，EHT减轻肝损伤——AST、ALT和TBIL降低、ALB升高（4周差异最显著），Masson三色、PicroSirius Red和α-SMA阳性面积分别减少51%、49%和41%，Col I、LN、Hyp和TGF-β1水平显著降低；RNA测序鉴定160个差异表达基因，上调基因涉及脂质代谢（Abcg5、Abcg8）、糖代谢和Wnt通路（Axin2、Gck）、炎症调节（Ccl5、Pomc）、细胞保护（Manf、Gdf15）和昼夜节律（Per2、Aox2），下调基因涉及ECM合成和纤维化（Fmod、Colla1、Lum、Fbln1、Plod2）、炎症反应（Cd44、Il6r、Cebpb）和能量代谢与ECM重塑（Ppargc1a、Adamsl5），GO分析显示上调术语包括"激素分泌""肽分泌调节""甘油三酯稳态"，下调术语包括"金属离子应激反应""T细胞分化""淋巴细胞分化""细胞外基质组装""结缔组织发育""胶原生物合成过程"，KEGG显示上调通路包括"缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解""谷胱甘肽代谢""药物代谢-细胞色素P450""胆固醇代谢""脂肪消化吸收"，下调通路包括"FoxO信号通路""ECM-受体相互作用""矿物质吸收"等。总之，这些发现表明EHT通过增强肝脏代谢修复和细胞保护同时抑制过度炎症反应和纤维化来发挥治疗作用，BSA-MA-dECM水凝胶是肝组织工程的有前景生物材料，支持其进一步开发用于转化植入策略和生物打印赋能的肝组织制造。